微生物的纯培养和显微技术
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微生物的基本技术
培养技术
- 培养物：微生物学中，在人为规定的条件下培养繁殖得到的微生物群体
- 混合培养物：含有多种微生物的培养物
- 纯培养物：只有一种微生物的培养物
显微技术
进行微生物研究的一项重要技术，因为绝大多数微生物的个体形态及其内部结构只能通过显微镜才能进行观察和研究
无菌技术
无菌技术是指在微生物实验操作过程中,防止被其它微生物污染和保持无菌物品及无菌区域不被污染的操作技术
微生物的分离和纯培养
无菌技术
- 用于分离、培养微生物的器具事先不含任何微生物
- 在转接、培养微生物时防止其他微生物的污染
常用的器具：试管、瓶子、培养皿等
常用的灭菌方法：
- 高压蒸汽灭菌：121 度，20min，高压蒸汽灭菌锅（效果最好）
- 高温干热灭菌：160 度，2h，电热恒温鼓风高温干燥箱
接种操作
无菌操作：火焰附近（酒精灯、煤气灯）进行
分离纯培养
培养基
用途：满足微生物的生长和繁殖
按照形态分类：液体培养基、固体培养基
用固体培养基分离纯培养
菌落：单个微生物在适宜的培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、具有一定形态结构的子细胞生长群体（菌落的形态和单细胞的形态不同）
菌苔：当固体培养基表面众多菌落连城一片时便成为菌苔
分离纯培养的方法：
- 涂布平板法
- 平板划线法
- 稀释倒平板法
- 厌氧微生物分离——稀释摇管法
液体培养基分离方法——稀释法
把含有细菌的液体稀释到非常低的浓度，然后分装到大量的试管中，以至于大多数试管（>95%）里连一个细菌都没有
方法：
- 你进行一系列稀释，直到样本中细菌的平均数_远小于_1 个/每份
- 你把这个稀释液分装到（比如）100 支平行的试管里
- 前提条件： 稀释的程度必须足够高，导致绝大多数（例如 95%）的试管因为没有分到任何细菌，所以不生长
假设我们有 10000 只试管，其中有 9500 只试管内一个细菌也没有，另外 500 个试管里面是有细菌的（≥1 个细菌）
在这 500 个试管内，符合泊松分布：
- 在_所有_试管中，含 1 个细胞的概率是 4.8%（即 10000 支中有 480 支）
- 在_所有_试管中，含 2 个细胞的概率是 0.12%（即 10000 支中有 12 支）
- 在_所有_试管中，含 3 个细胞的概率是 0.002%（即 10000 支中有 0.2 支）
- …（含 4 个或更多的概率极低，被忽略了）
我们所关心的核心问题是：如果我随手拿起一支_有生长的_试管，它来自单个细胞（纯培养）的概率是多大？
这是数学上的一个条件概率问题
其中有细胞的概率为：
选择培养分离
- 抑制大多数其他微生物的生长
- 使待分离的微生物生长更快（使待分离的微生物在群落中的数量上升，方便用稀释法对其进行纯化）
- 使待分离的微生物生长突出
选择培养分离
- 利用选择培养基进行直接分离 待分离的微生物生长，其他的微生物的生长被抑制
- 富集培养 利用不同微生物间生命活动特点的不同，制定的环境条件，使仅适应于该条件的微生物旺盛生长
单细胞（孢子）分离
- 一般采用显微操作仪，在显微镜下进行
- 操作难度与细胞或个体的大小成反比
- 单细胞（单孢子）分离可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离出单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养
二元培养物
培养物中只含有两种微生物，并且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物
- 病毒和宿主细胞
- 纤毛虫、变形虫和粘细菌
微生物的菌种保藏技术
影响微生物菌种稳定性的因素：变异、污染、死亡
菌种保藏的基本要求：在一定时间内使菌种不死、不变、不乱
菌种的衰退与复壮
菌种衰退的原因：大量群体中的自发突变
菌种衰退的本质是：在人工培养条件下，不产或者低产的突变体比高产的突变体长得更快，对于微生物来说，高产是一个高负担，因此更少的能量投入到自己的生长和繁殖上了，对于低产或者不产突变体来说，能将更多的能量投入到生长和繁殖中，因此产生优势
菌种的复壮：从衰退的菌种群体中把少数个体再找出来，重新获得具有原有典型性状的菌种
防止衰退的措施：
- 减少传代次数
- 创造良好的培养条件
- 经常进行纯种分离，并对相应的性状指标进行检查
- 采用有效的菌种保藏方法